注册
登录

分子生物学：SELEX Protocol

作者: 沃得玛雅

简介: 描述了‌SELEX技术‌（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）的详细步骤

最后修改: 2025-04-08 09:14:28.734162

文章状态: 已发布

标签:

技术 生物
  S E L E X （ S y st e m at i c  E v ol u t i on   of   L i ga nd s  by   E x po ne nt i al   E nr i ch m e nt ）是一种生物技术， 用于筛选和优化具有特定结合活性的单链核酸（如 DN A 或 R N A 分子） ，这些分子被称为适 配体 （ ap t am e r s ） 。 这种技术最初由 L ar r y   G ol d 和 J ack   S z ost ak 在 1990 年提出， S E L E X   技术 的核心思想是通过逐步的筛选和富集， 从一个大的随机核酸库中选择出能够与目标分子高度 特异性结合的短核酸序列。     S E L E X   主要分为以下几个步骤：   1.   筛选： 将核酸 片段 暴露于 拥有 目标分子 的环境， 让其结 合。 在经过离心和洗涤等方式去 除未能结合上的核酸片段。   2.   富集和扩增 ：通过   P CR   大 量复制通过筛选的核 酸片段 ，之后继续进行筛选工作，重复 进行以筛选出最能特异性结合的片段。   3.   建库 ： 为能够特异性结合的   DN A   片段加上测序用的标 签， 最后通过这些标签进行数据 统计。   1 . S E L E X 实验材料准备       1 . 1   蛋白（ 0 .1 m g/m l ;  - 80 冻存） ；冰上待用。   1 . 2   DN A （随机 - >3   l i br ar y ）   冰上待用   1 . 3   缓冲液（冰上待用） 。   S B :   S E L E X   bu f f e r :     使用 H 2O 等体积稀 释 2 * S E L E X   bu f f e r     1 . 4   S E L E X - bi nd i ng   bu f f e r   ( S - BB)   ( 5 m l )   药品名称   药品规格   用量   作用   S E L E X   bu f f e r   2 * S E L E X   bu f f e r   2 . 5 m l   提供反应环境   DT T   1M   2 . 5 μ l   保护蛋白   DI DC   ( 2 0 0 ng / μ l)   125 μ l   减少杂   DN A   结合   W at e r   去离子水   2 . 4 m l     N ot e :   以上是 配制   5 m l   的用量，具体用量根据需要的   bu f f e r   量进行调整     1 . 5   S E L E X - w ash   bu f f e r ( S - W B )   ( 5 m l )   药品名称   药品规格   用量   作用   S E L E X   bu f f e r   2 * S E L E X   bu f f e r   2 . 5 m l   提供反应环境   DT T   1M   2 . 5 μ l   保护蛋白   W at e r   去离子水   2 . 5 m l     N ot e :   以上是 配制   5 m l   的用量，具体用量根据需要的   bu f f e r   量进行调整     1 . 6   平衡磁珠 的反应环境   1. 将取出的磁珠置于磁力架上，将保存液 倒掉   2. 加入和磁珠总体积相等的 S - B B , 从磁力架上取出，混合均匀   3. 再次置于磁力架，将   S - BB  倒出   4. 重复步骤   2 - 3  两 次   5. 加入磁珠总体积的   0 . 8   倍的   S - BB ，混合均匀，完成 环境平衡   N ot e ：为了 留 出损耗空间，要用预期总用量 * 1 . 1 （用量详见步骤   2 . 4 ）  
    2 .   第一轮 S E L E X （筛选 & 富集）   2 . 1   蛋白核酸结合：向单个 0 . 2 m l   的   P C R   试管中加入 以下试剂：     体积   总量   蛋白   1 0  μ l   1 μ g   文库   0 . 7 μ l   ~1 .5 μ g   S - BB   8 9 . 3 μ l   8 9 . 3 μ l   N ot e : 具体体积根据 DN A   和蛋白质 浓度换 算，优先确 保总量。请根据 文库和蛋白的 量调整 S - BB 的量。可以最后加入 S - BB 以保证溶液混合均匀     2 . 2   制作对照组   为了确保可信度，需要使用三个不同的文库，同时每种文库需要一个空白对照组。   空白对照组成分如下：     体积   总量   水   1 0  μ l     文库   0 . 7 μ l   ~1 .5 μ g   S - BB   8 9 . 3 μ l   8 9 . 3 μ l     N ot e ：如果使用八联排试管，可以参考以下顺序添加     1.   2.   3.   4.   5.   6.   7.   8.   无   实验组 （ 1 ）   实验组 （ 2 ）   实验组 （ 3 ）   对照组 （ 1 ）   对照组 （ 2 ）   对照组 （ 3 ）   无   其中有着相同序号的实验组和对照组采用同一种文库     2 . 3  蛋白核酸结合   1. 在室温静置   10  分钟，等待蛋白质与核酸结合。     2 . 4   蛋白富集   1. 每个试管中加入 50 μ l  磁珠   2. 室温放置 2 0 m i n ，等待磁珠与蛋白质结合     2. 5   去杂     1.   放磁板静置 5 - 10  分钟，直到溶液清澈   2.   去上清   3.   加入 300 μ l （实际   270 μ 左右） S - WB   4.   从磁板中取出，混合均匀   5.   再次置于磁板上静置   5 - 10  分钟， 去上清   6.   重复步骤   3 - 5  三次   7.   加入   100 μ l 水，重悬     2 . 6  P CR 混合物 配制  
1. 配 制   P CR   环境   药品名称   药品规格   用量   作用   S E L E X   F   10 μ M   8 . 2 5 μ l   引物   S E L E X   R   10 μ M   8 . 2 5 μ l   引物   M ast e r   m i x   2 * M ast e r   m i x   8 2 . 5 μ l   核苷酸 & 酶   水     4 9 . 5 μ l     N ot e ：以上用量是一个试管的   P CR   用量，根据需要的量进行调整。   2. 向配好的   P CR   环境中加入   1 6 . 5 μ l 的磁珠混合物（步 骤   2 . 5   的最终成品）   3. 将已有的样本分成三等份，分别进行   1 2 , 1 5 , 2 0 轮 P CR     2 . 7   P CR   P CR   程序如下：   12  轮：   9 4 ℃   5 m i n   1 次   9 4 ℃   1 0 s   12 次   5 8 ℃   2 0 s   7 2 ℃   1 0 s   7 2 ℃   5 m i n   1 次   1 0 ℃   ∞   1  次     15  轮   9 4 ℃   5 m i n   1 次   9 4 ℃   1 0 s   15 次   5 8 ℃   2 0 s   7 2 ℃   1 0 s   7 2 ℃   5 m i n   1 次   1 0 ℃   ∞   1  次     20  轮   9 4 ℃   5 m i n   1 次   9 4 ℃   1 0 s   20 次   5 8 ℃   2 0 s   7 2 ℃   1 0 s   7 2 ℃   5 m i n   1 次   1 0 ℃   ∞   1  次     2 . 8   配 制 电泳胶     1. 配 制 3 %DN A   胶   药品名称   药品规格   用量   作用   琼脂     1 . 5 g     T A E   缓冲液   1*   5 0 m l     DN A   染料     10 μ l   染色 DN A  
N ot e ：以上是   5 0 m l   胶的配 制 用量，实际用量根据使用 量更改     配胶过程：   1. 将琼脂与   T A E   缓冲液混合   2. 使用微波炉 加热 至沸腾   3. 用凉水降温（从经验来讲   5 0 m l   的胶冲   6 - 7  秒，切 忌不能冲太久，避免凝固）   4. 加入   10 μ l   DN A   染料，混合均匀   5. 倒入制胶盒，等待冷却     2. 9   跑胶     1. 取   4 μ l   P CR 上清（步骤   2 . 7   的结果） 与   4 μ l   2 * l oad i ng   bu f f e r   混合   2. 加入   5 μ l   m ar k e r   3. 上样   6 μ l   4. 2 0 0 V   1 9 4 m A   1 0 m i n   5. 蓝光 / 紫外   观察条带， 取荧光最明显的   cy cl e   数（ P CR   轮数） ， 如果   cy cl e   间 的荧光相近， 取最少的   cy cl e   数     2. 10   纯化     1.   取最佳   cy cl e   数量的   P CR   的上清 40 μ l  加入一个新的八联排中   2.   加入   80 μ l   DN A   结合 磁珠   3.   加入   170 μ l 异丙醇   4.   室温下静置   10  分钟   5 .     放到磁板上 5 m i n （上清清澈就可以）   6 .     去上清（ DN A 此时已经结合在底部的 DN A   结合磁 珠 上）   7 .     加入 200 μ l   80% 乙醇   混匀   8 .     重复步骤   5 - 7   三次   9 .    放到磁板上 5 m i n （上清清澈就可以）   1 0 .  去上清（ DN A 此时已经结合在底部的 D N A   结合磁 珠上 ）   1 1 .  静置 1 0 m i n ，等待乙醇晾干   1 2 .  加入 12 μ l 水（把 DN A 从 DN A   结合磁珠 上取下来 ）   1 3 .   静置 2 m i n   1 4 .  放到磁板上 5 m i n   1 5 .  取出并保留 上清（ DN A 水溶液）得到样本     2. 11  成果检验   1 .   超微量分光光度计测定浓度（ 80 - 100 μ g/ μ l  为正常值 ）     3  第 2 - 3 轮 S E L E X     3 . 1   准备   P C R   混合物  
蛋白核酸结合：向单个 0 . 2 m l   的   P CR   试管中加入以下 试剂：     体积   总量   蛋白   1 0  ul   1ug   文库   0 . 7 u l   ~1 .5 ug   S - BB   8 9 . 3 u l   8 9 . 3 u l   N ot e :   这里的文库是上一次提纯完的   DN A （步骤   2 . 8   的结果） ， 具体体积根据浓度换算。 优 先确保总量。请根据文库和蛋白的量调整 S - BB 的量。 可以最后加入 S - BB 以保证溶液混合 均匀     其余操作与第一轮   S E L E X   相同， 从大步骤   2  开始 （确 切来说是   2 . 3 ， 对照组制作把水替换 完上一次   P CR   之后的对照组） 。如果药剂用完自行 配制     4 .  建库   N ot e ： 这 一大步 骤的 目的 是给 已经 纯化 好的 蛋白 打上 不同的 标签 ，在 测序 中起 到分 类的作 用。   I 标签：区分不同的用户   Q 标签：区分一个用户的不同样本     4 . 1   准备   P CR   混合物（ Q  标签）   药品名称   药品规格   用量   作用   S E L E X   F （ Q   t ag ）   10 μ M   1 μ l   加   Q  标签   S E L E X   R （ Q   t ag ）   10 μ M   1 μ l   加 Q  标签   M ast e r   m i x   2 * M ast e r   m i x   10 μ l   核苷酸 & 酶   水     7 μ l     N ot e ：不同的样品中要加入有着不同   Q   t ag   的   F 和   R  引物   2. 加入 1 μ l   DN A   到 P CR   混合物中   3. 准备一组阴性对照（ ne ga t i v e   con t r ol ） ，把 1 μ l   DN A 替 换成 1 μ l 水。     4. 2   第一轮 P CR     94 ℃   5 m i n   1  次   94 ℃   10s   8  次   55 ℃   20s   72 ℃   10s   72 ℃   5 m i n   1  次   10 ℃   ∞   1  次       4. 3 跑胶   1. 电泳胶  
药品名称   药品规格   用量   作用   琼脂     0 . 7 5 g     T A E   缓冲液   1*   5 0 m l     DN A   染料     10 μ l   染色 DN A   N ot e ：以上是   5 0 m l   胶的配 制 用量，实际用量根据使用 量更改     配胶过程：   1. 将琼脂与   T A E   缓冲液混合   2. 使用微波炉 加热 至沸腾   3. 用凉水降温（从经验来讲   5 0 m l   的胶冲   6 - 7  秒，切 忌不能冲太久，避免凝固）   4. 加入   10 μ l   DN A   染料，混合均匀   5. 倒入制胶盒，等待冷却     4 . 4 跑胶     1. 取   4 μ l   P CR 产物（步骤   4 . 2 的结果）与   4 μ l   2 * l oad i ng   bu f f e r   混合   2. 加入   5 μ l   m ar k e r   3. 上样   6 μ l   4. 2 0 0 V   1 9 4 m A   1 0 m i n     4 . 5   观察跑胶   1. 观察杂带情况，过多可能需要重新 P CR   2. 观察主带长度， 如果和   m ar k e r   不 匹配， 可能需要重新   P CR （这一步的长度在   150bp  左 右）   3. 观察阴性对照，如果出现条带，可能需要重新   P CR     4 . 6 准备   P CR   混合物（ I  标签）   药品名称   药品规格   用量   作用   S E L E X   F （ I   t ag ）   10 μ M   1 μ l   加   I   标签   S E L E X   R （ I   t ag ）   10 μ M   1 μ l   加 I   标签   M ast e r   m i x   2 * M ast e r   m i x   10 μ l   核苷酸 & 酶   水     6 μ l     N ot e ：每个人的样品加入同样的   I  标签   2. 加入 2 μ l  第一轮   P CR   产物（步骤   4 . 2 的结果）到 P CR   混合物中   3. 准备一组阴性对照（ ne ga t i v e   con t r ol ） ，把 2 μ l  第一轮 阴性对照组加入   P CR   混合物     4 . 7   第二轮   P CR   94 ℃   5 m i n   1  次   94 ℃   10s   8  次   55 ℃   20s   72 ℃   10s   72 ℃   5 m i n   1  次  
10 ℃   ∞   1  次     4 . 8 跑胶   1. 配制 电泳胶   药品名称   药品规格   用量   作用   琼脂     0 . 7 5 g     T A E   缓冲液   1*   5 0 m l     DN A   染料     10 μ l   染色 DN A   N ot e ：以上是   5 0 m l   胶的配 制 用量，实际用量根据使用 量更改     配胶过程：   1. 将琼脂与   T A E   缓冲液混合   2. 使用微波炉加 热 至沸腾   3. 用凉水降温（从经验来讲   5 0 m l   的胶冲   6 - 7  秒，切 忌不能冲太久，避免凝固）   4. 加入   10 μ l   DN A   染料，混合均匀   5. 倒入制胶盒，等待冷却     4 . 9 跑胶     1. 取   4 μ l   P CR 产物（步骤   4. 7 的结果）与   4 μ l   2 * l oad i ng   bu f f e r   混合   2. 加入   5 μ l   m ar k e r   3. 上样   6 μ l   4. 2 0 0 V   1 9 4 m A   1 0 m i n     4 . 1 0   观察跑胶   1. 观察杂带情况，过多可能需要重新 P CR   2. 观察主带长度， 如果不和   m ar k e r   匹配， 可能需要重新   P CR （这一步的长度在   270bp  左 右）   3. 观察阴性对照，如果出现条带，可能需要重新   P CR     5.   切胶回收   DNA   5 . 1 . 配 制 电泳胶   药品名称   药品规格   用量   作用   琼脂     0 . 7 5 g     T A E   缓冲液   1*   5 0 m l     DN A   染料     10 μ l   染色 DN A   N ot e ： 以上是   5 0 m l   胶的 配制 用量， 实际用量根据使用 量更改。 这次制胶时梳子放在长方形 的短边，让跑胶的距离变长     5 . 2   跑胶   1. 将所有   P CR   产物 （步骤   4 . 7   的结果） 集中到一个管 中 （如果严格按照之前的步骤， 现在 应该有   96 μ l ） 。  
2. 加入 P CR   产物   1 /9  体积的 10 * l oad i ng   bu f f e r   混合均 匀制成样品 （ 96 μ l   P CR   产物的话就 加入   1 0 . 6 7 μ l  的   1 0 * l oad i n g  bu f f e r ）   3. 在一个孔中尽可能的加入所有的样品   4.   180 V   1 9 4 m A   2 0 m i n     5 . 3   切胶   1. 把整块胶置于蓝光切胶仪中，观察目标条带位置   2. 用刀片仔细切下含有主带的胶，尽可能少的留下别的胶     5 . 4   溶胶   1. 称量胶的质量，之后加入 3  倍胶体积的   Q G   bu f f e r （溶胶剂）   N ot e : 1 0 0 m g 胶 =1 0 0 μ l 。也就是说每   1 0 0 m g 胶加入   3 0 0 μ l  的   Q G   bu f f e r 。     2. 放到 50 度   10 分钟，等待胶完全溶解   N ot e : 如果是黄色就可以，如果橙色或者紫色就加入 10 μ l   3 M 醋酸钠   ( pH   5 . 0 )     5 . 5   纯化   1. 加一倍胶体积 （胶体积换算见步骤   5 . 4 . 1 ）的 异 丙醇， 转 入 M i nE l u t e   过滤管中， 套在一个 剪掉盖子的 离心管 上方     2. 晃匀之后 用 离心机 （没有特定参数， 龟背离心机即可 ） 将上面的液体过滤 到下方离心管之 中，倒掉即可     3. 加入   500 μ l   Q G   bu f f e r ，放入离心机中离心（ 1 3000 R P M   1 分钟） ， 倒掉过滤下来的 废液 。     4. 加入   750 μ l   P E   bu f f e r ， 放入离心机中离心 （ 1 3 0 0 0 R P M   1   分钟） ， 倒掉过滤下来的废液， 重 复两次。   N ot e ：如果做的是对于盐敏感的测试，加入   B u f f e r   P E   后静置   5  分钟     5. 准备 5 5  ℃的 水 ， 更换 底部管子， 加 55 ℃ 水 20ul （加 在正中间， 不要触碰到 管 壁） 静置 1 分钟     6. 放入离心机中离心（ 1 3 0 0 0 R P M ， 1  分钟）     7. 取底部小试管里的 DN A 水溶液     5 . 6   检查结果   1. 检查蛋白含量， 盐含量和核酸含量 （核酸正常浓度在   8 0 ~1 2 0 ng / μ l ， 蛋白和盐的含量不超 过核酸浓度就可以接受）     核酸吸光度峰值： A D26 0   蛋白吸光度峰值： A D23 0   盐吸光度峰值： A D28 0   2. 送去测序，等待结果。  
创建一个文章