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分子生物学：从转质粒到提蛋白

作者: 沃得玛雅

简介: A detailed protocol of plasmid transfection and protein extraction.

最后修改: 2025-04-08 09:14:50.961523

文章状态: 已发布

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技术 生物
        分子生物学：从质粒 转化 到蛋白 提取   简介： 此技术的主要目的是得到目标蛋白。 通过向细菌中转入带有目标蛋白基因 的质粒来让细菌表达目标蛋白。之后通过磁珠法提纯蛋白。     主要步骤：   1.   质粒转化：将带有目标蛋 白基因，筛选片段 以及 调节片段的质粒转入细菌体 内。   2.   细菌培养和筛选：将细菌 置于培养基内让其 自行 扩增，后将扩增完成的细菌 置于带有抗生素的培养基内进行筛选。   3.   蛋白表达测定：通过电泳的方式来观察目标蛋白是否成功表达   4.   蛋白纯化：通过磁珠法将目标蛋白从细菌中分离出来     1  药剂配 制   液体培养基   药品名称   药品规格   药品用量   药品作用   L B   液体培养基粉 末     2 . 5 g   提供必要的营养 以及琼脂   去离子水     1 0 0 m l     N o t e ：以上是   1 0 0 m l   配置的用量，具体用量根据比例进行调整   固体培养基（ k an a ）   药品名称   药品规格   药品用量   药品作用   L B   固体培养基粉 末     4g   提供必要的营养 以及琼脂   去离子水     1 0 0 m l     K an a  抗生素   1 0 m g /m l   500 μ l   筛选细菌   N o t e ： 以上是   1 0 0 m l   配置的用量， 具体用量根据比例进行调整。 抗生素种类根 据质粒类型自行调整 ,  终浓度   50 μ g /m l .     液体培养基（ k an a ）   N o t e ：所有的培养基必须进行高压灭菌 ， 121 ℃， 15  分钟   药品名称   药品规格   药品用量   药品作用  
L B   液体培养基粉 末     2 . 5 g   提供必要的营养 以及琼脂   去离子水     1 0 0 m l     K an a  抗生素   1 0 m g /m l   500 μ l   筛选细菌   N o t e ： 以上是   1 0 0 m l   配置的用量， 具体用量根据比例进行调整。 抗生素种类根 据质粒类型自行调整，终浓度   50 μ g /m l .     No t e ： 所有培养基配置完成后都使用微波炉完全 煮沸 。 等培养基放凉至温热后加 入抗生素。培养基温度过高可能会导致抗生素 变性。     Tris - HC L   b u ff e r   药品名称   药品规格   药品用量   药品作用   Tris   1M   4 m l     NaC l   5M   6 m l     去离子水     9 0 m l     N o t e ：以上是   1 0 0   m l   的用量，终浓度确保   4 0 m M   t r i s   和   3 0 0 m M   NaC l   W as h   b u ff e r   药品名称   药品规格   药品用量   药品作用   Tris - H C L   b u ff e r   如上   1 0 0 m l     咪唑   粉末   0 . 3 3 g     N o t e ：以上是   1 0 0   m l   的用量，终浓度确保   2 0   m M 咪唑     E l u t i o n   b u ff e r   药品名称   药品规格   药品用量   药品作用   Tris - H C L   b u ff e r   如上   1 0 0 m l     咪唑   粉末   4 . 2 g     N o t e ：以上是   1 0 0   m l   的用量，终浓度确保   2 5 0   m M 咪唑       2. 质粒转化   N o t e ：以下操作要在无菌环境下进行 操作   1.   准备解冻好的感受态细菌 （ R o s e t t a ） 和解冻好的质粒 （ p C U1 9 ）  
2.   向离心管中加入   50 μ l  感受态细菌   3.   向离心管中加入   0 . 5 μ l 质粒（ 16 n g / μ l ）   N o t e ： 质粒总量根据感受态细菌转化效率调整。 通常来讲   100 μ l  细菌   1 n g   质粒 就够用。但是多加一些没有坏处   4.   冰浴 30 分钟   5.   42 ℃水浴锅中热激 60  秒   6.   冰浴   2 分钟     3.   细菌扩增   N o t e ：以下操作要在无菌环境中进行操作   1. 向冰浴完成的细菌中加入   150 μ l  液体培养基（无抗生素）   2. 摇床   37  ℃ ， 2 2 5 r p m   复苏 45  分钟   3. 向培养皿中导 入   15 - 2 5 m l   的固 体培养基 （ k an a ） ，将培养 皿的盖子 微微打开， 开口朝向酒精灯，直到固体培养基完全凝固   4. 取   50 μ l 复苏好的菌液均匀涂抹在固体培养基中   N o t e ：这一步需要完全涂干， 一般来说如果涂抹 的时候有涩的感觉就可以了     5 . 3 7   ℃恒温箱 倒置 培养   16  小时。   6. 将板子上的单克隆菌落挑入   2 m l   液体培养基中 （ k an a ）， 3 7   ℃   2 2 5 r p m ，   16 小时   7. 将   2 m l   培 养 好的 菌液 按照   1 : 1 0 0 全 部接 种 到液 体 培 养基 （ k an a ） 中 ， 37  ℃   2 2 5 r p m 。 培育到 到   O D 6 0 0   0 . 6 - 0 . 8   N o t e ： 接种到多少毫升的菌液中看需求， 根据比例自行调整 。 要培养到） O D6 0 0   0 . 6 - 0 . 8   通常需要   3 - 4  小时     8. 取出   1 m l   菌液备用。   9. 冰上放置   10  分钟   10. 按照   1 i p t g   : 1 0 0 0 菌液   的比例向菌液中加入   i p t g （ 0 . 1 M ） ， 摇床 37 ℃   2 2 5 r p m   培育   3  小时。     4. 表达测定   1.   收集培养好的菌液，将培养好的菌液放入离心管中   2.   离心 5 0 0 0 r p m   5 分钟 。去上清留菌  
3.   称量细菌质量（先把对应 的，没有细菌容器 放在 秤上，去皮，再称量带有细 菌的容器）   4.   按照 1 g   细菌加入   9 m l   T r is - H C L   缓冲液 ， 重悬   5.   按照   1 铁锤： 9   Tris - H C l   的比例加入铁锤裂菌液   6.   室温或者冰箱   4 ℃裂解   10  分钟   7.   将在步骤 3 . 8   中 取出的 菌液 离心， 5 0 0 0 r p m   5   分钟。去 上清留 菌 加入   20 μ l  1 * l o ad i n g   b u ff e r 。 100  ℃水煮   15  分钟。 离心 1 3 0 0 0 r p m   1 0   分钟。 作为阴性 对照备用   8.   将裂解好的菌液（步骤   4 . 6   的结果）离心， 4 ℃， 1 3 0 0 0 r p m   1 0   分钟。   9.   将上清转移到新的离心管中，剩下的团块弃置   10.   取   10 μ l  上清与   2 μ l   5 * l o ad i n g   b u ff e r   混合。 100 ℃煮   5  分钟。 作为 总蛋白样 本   N o t e ：这里可以多准备一到两个样本。之后还会 作为对照使用   11.   跑胶 （阴性对照和 蛋白总 样本） ， 每样   10 μ l 。 如果出现目标条带， 进行接下来 的操作     5 蛋白纯化   1.   按照每 1 m l   菌液上清 （步骤   4 . 9   的产物 ） 加入   400 μ l  磁珠的 比例取出 1 . 1   倍磁珠 。   N o t e ：接下来的用量都是   1 m l   上清的用量 ，这 里拿出的是   440 μ l 。用量按比例 根据上清 量 调整。   2.   置于磁力架上，倒掉保存液。   3.   加入等体积的   Tris - H C l   b u ff e r ，吹匀。再次置于 磁力架上   4.   重复步骤   3 两次   5.   最后加入总体积   0 . 8 倍的   Tris - H C L   b u ff e r 。   6.   向   1 m l   菌液的上清 （步骤   4 . 9   的产物） 中加入   400 μ l  磁珠 （步骤   5. 5   的产 物）   7.   放在冰上   1  小时，不时 摇晃   8.   置于磁力架上，取   10 μ l  上清与   2 μ l   5 * l o ad i n g   b u ff e r   混合。作为流穿样本。   9.   置 于磁力架上，倒掉上清，加入   800 μ l   w as h   b u ff e r   摇匀 ,  再 倒掉 。   10.   重复步骤   8  两次   11.   加入   240 μ l   e l u t i o n   b u ff e r 。摇匀，至于磁力架上 。取出上清，作为   e1 样品   12.   再次加入   240 μ l   e l u t i o n   b u ff e r 。 摇匀， 至于磁力 架上。 取出上清 ,  作为   e2 样
品   6  最终成果检验   1.   各 取 e 1   和   e 2   1 0 μ l 。与   2 μ l   5 * l o ad i n g   b u ff e r   混合 ， 作为 提纯 样本   2.   将总蛋白样本 （步骤   4 . 1 0 的结果） ， 流穿样本 （ 步骤   5 . 7 的结果 ） ， 提纯样本 （步骤   6 . 1   的结果） 一起进行跑胶。   No t e ： 理想 结果是， 总蛋白样本拥有全部条带， 流穿样本没有目标条带， e1 和 e2 只有目标条带， e2 拥有更少的杂带。     13.   使用分光光度计测量最总浓度。  
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